一、免疫测定方法
目前已报道的免疫测定方法主要有免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),这两种方法均是用于患者血清中特异抗体的检测。
免疫荧光试验测定的特异性强,但测定的灵敏度较低,可测到出现症状约十天的SARS病人血清中的特异抗体IgM或IgG。它需要使用固定的SARS病毒颗粒、荧光显微镜和有经验的使用荧光显微镜的实验技术人员。抗体检测为阳性表示病人感染了病毒。
ELISA方法则以裂解的病毒颗粒成分作为抗原,包被聚苯乙烯微孔板孔,可采用间接法测定患者血清中的特异抗体IgG。从出现症状和体征约21天检测SARS病人血清中的抗体是可靠的。
阳性抗体测定结果:表示有既住SARS冠状病毒(CoV)感染,血清从阴性转变为阳性或从急性期到恢复期血清抗体滴度升高4倍,提示为近期感染。
阴性抗体测定结果:症状出现21天后未测出抗体,说明无SARS病毒感染。
二、分子诊断方法
由于SARS病毒的核酸序列已经明确,WHO也公布了病毒核酸扩增检测的七对引物,这些引物已被世界上很多国家采用,因此国内外迅速建立了SARS病毒的RT-PCR检测方法,从而可以检测患者或疑似患者不同标本(血液、粪便、呼吸道分泌物或身体组织)中的SARS病毒。通常,病毒感染后,在感染者体液中最先会有病毒颗粒的存在,血循环中特异抗体的出现要晚很多天,故RT-PCR方法可用于病毒感染的早期诊断及疑似感染者的确诊。现在已经有了可以直接使用的含有引物、阴性质控和阳性质控的检测试剂盒。现全球参与SARS研究的网络实验室成员进行此类试剂盒的多中心研究,相互比较,以评估其性能。国内也有了SARS病毒检测的荧光RT-PCR试剂盒。现有的RT-PCR检测较为特异,但灵敏度不是太高。再则,目前已有的RT-PCR方法所扩增的核酸片段不一定为所有SARS病毒所共有,因为现在SARS病毒的基因库尚未建立,故还不能确定所有SARS病毒都具有的共有序列。这意味着RT-PCR诊断实验的阴性结果并不能说明没有 病毒,阴性的检测结果并不能排除病人携带病毒的可能性。
进行上述有关SARS病毒感染的实验室检测必须有质量控制措施,并通过室间质量评价与其它实验室的结果进行比较。对于阳性结果必须按照一个严格的程序进行确认,尤其是在低感染流行地区,因为在这些地区阳性预示值较低。RT-PCR检测在每次均要包括适当的阳性和阴性质控物。阴性质控应抱括监测提取方法的阴性标本和一个监测PCR的水质控。阳性质控用于监测PCR和核酸提取过程,并同时对每一份患者标本做一份平行样本检测,在平行样本中加入弱阳性质控物以监测可能存在的对PCR有抑制的物质。如果RT-PCR检测为阳性,则应该进行下述实验确认:(1)对同一份原始标本进行重复实验;(2)扩增病毒的第二个基因组区域;或在另一个实验室对同一份标本进行检测。
阳性RT-PCR测定结果:如果有严格的室内质控措施,WHO所推荐的SARS-CoV RT-PCR测定方法是非常特异的,阳性结果说明标本中存在SARS-CoV的核酸,但并不意味着存在活病毒,或说明其对他人具有传染性。
阴性RT-PCR测定结果:不能排除SARS。阴性结果的解释是:(1)病人并未感染SARS病毒;该疾病由其它传染源(病毒、细菌、真菌)或非感染源引起。(2)假阴性。因为方法的检测灵敏度不够,或是病毒基因型的差异,或PCR引物的局限性。(3)标本没有在病毒或核酸物质可能存在的时间内采集(特指PCR和细胞培养)。病毒可能仅在很短的时间内存在,与检测标本的类型有关。
WHO建议连续收集和储存病人标本,从而可以直接有效的诊断SARS。这对于没有报道SARS的国家或地区的首例病人的识别尤其重要。
三、病毒培养
来自于SARS病人标本(如呼吸道分泌物、血液或粪便)中的病毒可以通过病毒培养来进行检测。当病毒经细胞培养分离出来后,可以用进一步的实验来证实其是否为SARS病毒。病毒培养通常对实验室要求很高,在普通的临床实验室难以进行,但它是唯一能证实活病毒存在的方法。
阳性结果:表明测定标本中存在活病毒。
阴性结果:不能排除SARS。原因参考阴性RT-PCR结果解释。
参考文献
1. Severe acute respiratory syndrome (SARS): Laboratory diagnostic tests www.who.int/csr/sars/diagnoetictests/en/print.htm1
2. Recommendations for laboratories testing by PCR for presence of SARS coronavirus –RNA www.who.int/csr/sars/diagnoetictests/en/print.htm1