J S M Peiris, C M Chu, V C C Cheng, K S Chan, I F N Hung, L L M Poon, K I Law, B S F Tang, T Y W Hon, C S Chan, K H Chan,
J S C Ng, B J Zheng, W L Ng, R W M Lai, Y Guan, K Y Yuen, and members of the HKU/UCH SARS Study Group*
摘要
背景：我们对于这次社区的SARS疾病暴发的临床学、放射学和病毒学的改变进程进行了阶段性的研究。
方法： 我们对使用了病毒唑和皮质类固醇的标准治疗方案进行治疗的75名病例进行了为期3 周的随访。并对疾病的临床模式、病毒量、导致临床治疗效果不佳的危险因素以及病毒学诊断方法的有效性进行了评估。
结果：发热和肺炎症状最初得到了改善，但是有64名病例（85％）在经过了平均8.9天（标准差为3.1）后再次出现了发热；55名病例（73％）在7.5天（标准差为2.3）后出现了水样腹泻；60名病例（80％）在7.4天（标准差为2.2）后胸片出现恶化；34名病例（45％）在8.6天（标准差为3.0）后呼吸道症状加重。34名病例（45％）最初的肺部损害得到改善，但是胸片显示伴随着其它部位出现新的损害。在第三周有9名病例（12％）出现了自发性的纵隔气肿，而15名病例（20％）出现了急性呼吸窘迫综合征。对14名病例的（其中4名出现了急性呼吸窘迫综合征）的鼻咽部分泌物的样品做了定量的逆转录聚合酶链反应测试，显示在入院后的第10天的病毒量达到最高峰，而在第15天的病毒量比入院时更少。年龄和慢性乙型肝炎感染者使用lamivudine 治疗是病情进展到急性呼吸窘迫综合征的重要的独立的危险因素（P值=0.001）。第14天在67名病例的粪便样品中用逆转录聚合酶链反应测试法检测，在65名病例（97％）的样品中查到了与SARS疾病相关的冠状病毒。这意味着血清转化的时间是发生在发病后的第20天。
解释：临床进展、胸片的渗透性改变的移动性以及倒V字型的病毒量变化的一致性表明，在第2周的病情加重与无法控制的病毒复制并不具相关性，而可能是与免疫病理学的损害相关。
简介：
SARS疾病是一种新出现的疾病，已经感染了许多的国家，目前大约报告了3500名病例。一种新型病毒，即与SARS疾病相关的冠状病毒已经被确认为是此种疾病的致病因子。以前已经报道过有关发病初期的临床学、放射学和其它方面的研究结果，但是对于疾病的进展过程尚不清楚。病毒传播的途径和持续时间，以及在疾病的不同阶段用于诊断的最好的临床样品目前也大都不清楚。从2003年3月24日开始，涉及到321名病例的SARS疾病大暴发出现在香港的一个高层公寓----陶大花园中。流行病学调查表明这是一起点源性的暴发，与下水道系统的破损有关。最初是通过引发病例的排泄物所污染，引发病例分别于3月14和19日到此公寓拜访亲戚。最先出现的75名成人病例，分别属于57户家庭，被诊断为SARS临床病例而收入同一家医院。我们对这75名病例做了历时24天的有关临床学、血液学、放射学和微生物学的前瞻性研究，并将研究结果与治疗以及鼻咽部分泌物样品中的病毒量作了相关分析，以阐明发病机理和治疗效果。我们报告了不同的临床样品用作病毒学诊断的有效性，以及其在疾病传播中的重要性。
病例和方法
病例
在2003年3月24日到28日，我们调查了来自陶大花园，被收入联合基督医院进行治疗的，符合世界卫生组织修订的SARS病例定义的75名病人。简单地说病例定义是：发热，体温在38℃或38℃以上，咳嗽或气短、胸片或者CT显示肺部出现新的渗透性改变，并对所出现的临床表现缺乏其它的解释。这些病例与其他SARS病例一起进行隔离护理。
方法：
研究得到香港联合基督医院的道德伦理委员会的批准。我们将每天所收集到的基于病史、体格检查、氧饱合度测定、血液学、生物化学、放射学和微生物学研究的临床结果输入预先建好的数据库中。在入院时和发病后的第14天，我们从所有的病例上采集鼻咽部分泌物样品和血斑用于病毒学测试。我们每天都为每一个病例做前后位的胸片。所有的胸片都由放射学专家和呼吸科医生共同分析报告。我们对明显正常、可疑的或非典型的胸片病例进行高分辨性的胸CT检查。对出现了急性呼吸窘迫综合征的病例，并且动脉氧分压（PaO2）与吸气末压分数（FiO2）的比值低于26.6千帕，记录急性生理学和慢性健康评价Ⅱ（APACHEⅡ）的评分。
在20 名病例的最初的鼻咽部分泌物样品中，通过逆转录聚合酶链反应测定法检测到了与SARS疾病相关的冠状病毒的RNA。此后我们每3 天收集一次鼻咽部分泌物、尿液和粪便样品。对于这些病例中的14名病例，我们对在出现症状后的第5、10、15天收集到鼻咽部分泌物样品用了定量的聚合酶链反应测定法检测。对所收集到的鼻咽部分泌物样品使用快速免疫荧光抗体测定法，分别对流感病毒A和B、副流感病毒1、2、3型、呼吸道合胞体病毒以及腺病毒进行测定了。并用Mardin Darby Canine Kidney、LLC-Mk2、RDE、Hep-2、MRC-5和弥猴胎儿肾细胞（FRhK-4）做了传统的呼吸道病原体的培养。用于检测SARS冠状病毒的逆转录聚合酶链反应检测法是直接在所有的临床样品中做的。简单地说，来自于临床样品的所有RNA可通过任意的六聚物进行逆转录，而cDNA通过引物5’TACACACCTCAGCGTTG-3’和5’-CACGAACGTGACGAAT-3’扩增。在实时的定量聚合酶链反应测定中，cDNA是在一种SYBR Green Ⅰ的荧光反应物中进行扩增的。一般来说，20μL的反应混合物中含有2μL的cDNA、3.5mmol/L的氯化镁溶液以及0.25μmol/L的相同的正相和反相引物，且反应混合物通过一个光循环加热器（Roche，Mannheim；95℃，10min；随后是50转速，95℃，10min；57℃，5s；72℃，9s。）被循环加热。质粒和目标序列用于绘制标准曲线。在测试后，聚合酶链反应的产物（182bp）用于混合曲线分析（65-95℃，0.1℃/s），以找出测试方法的特异性。平行地测定急性期和康复期的血清，用于检测与SARS疾病相关的冠状病毒的IgG，通过接种了SARS疾病相关的冠状病毒的Vero细胞固定在丙酮中，以间接免疫荧光形式测定。
正如临床表现所提示的那样，我们对血液、痰液或者是气管内分泌物以及尿液中进行了细菌学研究。再次出现发热的所有病例都逐步发展了脓血症。粪便用做常规的细菌学培养，Clostridium difficile 细胞毒素测定，并选择一些病例的样品用作寄生虫检测。
所有的病例每8小时静脉注射1.2g的羟氨苄青霉素，并且每天口服500mg的azithromycin。对于已知有青霉素过敏的病例，我们每24个小时给予口服500mg levofloxacin。一旦确诊为SARS病例，连续14天每8小时静脉注射8mg/kg的病毒唑。限量摄入氢化可的松（开始剂量为每8小时静脉给药200mg）,一直持续10天，然后口服脱氢皮质甾醇11天（1mg/kg 持续5天，0.5mg/kg持续3天，0.25mg/kg持续3天）。如果病情出现恶化，即气短、氧饱合度下降和胸片情况加重，我们使用甲基强的松龙500mg静脉给药，每天2-3剂。对于所有的乙肝表面抗原阳性的病例，当使用皮质类固醇时，每天口服100mg lamivudine。
统计分析：
与急性呼吸窘迫综合征的进展相联系的危险因素，对绝对变量我们使用Fisher’s精确检验，对连续变量使用Student’s T检验。经过单变量分析所确定的重要的危险因素进一步用多无回归分析，以确定与急性呼吸窘迫综合征的进展相联系的独立的危险因素。我们把P值<0.05认为有显著性。我们使用SPSS（11.0版本）软件来做所有的分析。
资金的提供者在研究中的作用
本研究的资助者没有参与研究设计、资料收集、资料分析、资料解释或者是撰写报告。
结果：
在75名病例中，71名病例（95％）都是中国人，其余的是菲律宾人。男性病例与女性病例的比例为1：0.92，平均的年龄为39.8岁（标准差为12.2）。5 名病例吸烟。13名病例原先有其它疾病，其中有9名病例的表面抗原阳性，但是没有出现慢性肝病的特征并且肝功能测试正常。收入医院时的临床症状包括75名病例（100％）均出现发热；49名病例（65％）出现寒战；42名病例（56％）出现发冷；51名病例（68％）出现肌肉痛；22名病例（29％）出现咳嗽；8名病例（11％）出现咽喉痛；3名病例（4％）出现气短；11名病例（15%）出现头痛；3名病例（4％）出现头昏眼花；1名病例（1％）出现腹泻。
53名病例（71％）最初的胸片检查不正常；37名病例（49％）病灶局限在一个肺区；16名病例（21％）病灶在多个肺区。45名病例（60％）出现低肺区的渗透性病变或融合病变。对33名（44％）胸片显示正常、可疑或是非典型的病例做了初次的高分辨的CT检查。在这33名病例中，有18名病例（55％）不正常仅局限于一个肺区。另外的15名病例（46％）可见多肺区的病变。在8名病例（24％）中，仅看到局灶性毛玻璃样病变；12名病例（36％）只出现融合性病变；另外13名病例（39％）出现两种类型的渗透性改变。
关于血液学和生物化学的研究，6名病例（8％）出现了贫血；5名病例（7％）出现了白细胞减少症；56名病例（75％）出现了严重的淋巴细胞减少症，淋巴细胞低于1ⅹ109/L；28名病例（37％）出现了血小板减少症。增高的值有：22名病例（29％）的丙氨酸转氨酶增高（42-343U/L），24名病例（32％）的天门东氨酸转氨酶增高（39-302U/L），27名病例（36％）的肌氨酸酐激活酶增高（176-1466U/L）。淋巴细胞计数的中位数从入院时的0.8ⅹ109/L分别下降至第7天的0.6ⅹ109/L（0.5-0.9），第14天的0.4ⅹ109/L(0.3-0.5)以及第21天的0.4ⅹ109/L(0.3-0.6)。
从疾病的进程来看，除了一名病例以外，其他的所有病例在使用标准的治疗方案后于48小时之内退热。但是有64名病例（85％）在平均8.9天（标准差为3.1）再次出现发热。这些病例中只有10名病例出现了脓血症的阳性结果：其中3名病例出现了Stenotrophomonas maltophilia 菌血症；4名病例有与导尿管有关的脓血症的临床证据；另外3名病例出现了非医源性的肺炎，其中2名病例是由Klebsiella pneumoniae所引起，而另一名是由大肠埃希氏菌所引起。对于所有的出现脓血症的病例都使用适当的抗菌药进行治疗，并去掉了受到污染的导尿管。在其余的54名病例中，平均8.0天（标准差为2.1）后再次出现发热，这不可能是由在医院中所受到的感染而引起。在第13天到15天，17名病例（23％）出现了再一次的发热。
55名病例（73％）出现了水样腹泻，开始出现的时间平均为7.5天（标准差为2.3）。腹泻的高发时间平均为8.7天（标准差为2.3），最大的频率为每天6.3次（标准差为3.5）。对引起腹泻的病原体，包括C difficile 细胞毒素进行了检测，在所有的病例中都是阴性的。腹泻的平均持续时间为3.9天（标准差为2.3）。24名病例（32％）同时出现了发热和腹泻。16名病例（21％）伴随着发热、腹泻，胸片也显示恶化。所有病例的腹泻症状到第13天均得到改善。
60名病例（80％）的胸片在平均7.4天（标准差为2.2）时显示恶化；34名病例（45％）显示有损害病灶的移动，表现为原先损害的愈合伴随着新的损害的出现；26名病例（35％）出现原先损害的加重，伴随或者不伴随新的损害的发展。总的来说，46名病例（61％）病情逐步地得到改善；11名病例（15％）的病情直至撰写此报告时仍然保持原状；而18名病例（24％）进一步加重，平均在12.0天（标准差为4.4）发展成弥散的毛玻璃状病灶。在出现弥散的毛玻璃状病灶的18名病例中，有15 名病例出现了急性呼吸窘迫综合征。在所有的75名病例中，有9名病例（12％）在研究过程中出现了自发性的纵隔气肿。
33名病例（44%）出现了动脉氧饱合度的下降，在呼吸室内空气时低于90％，在出现症状后的平均9.1天（标准差为4.2）出现。24名病例（32％）在平均11.0天（标准差为6.4）时需要重症特别护理，其中19名病例在平均12.9天（标准差为6.4）需要进行气管插管。15名病例（20％）发展成急性呼吸窘迫综合征并需要机械通气。在对出现急性呼吸窘迫综合征病例施行机械通气的第一天，平均的动脉氧分压（PaO2）与吸气末压分数（FiO2）的比值为14.7千帕（标准差为10.8），平均的APACHEⅡ评分为22.3（标准差为5.8）。出现急性呼吸窘迫综合征的时间表现为双峰模式，第一个峰出现在11.0天，而另一个峰出现在20.0天。7名病例在重症监护病房接受治疗时出现了医源性感染，包括3名病例感染了医源性肺炎；1名病例出现了耐meticillin的表皮葡萄球菌菌血症；另外3名病例出现了临床脓血症，并且没有阳性的培养结果。
通过单变量分析，与需要机械通气和重症特别护理的急性呼吸窘迫综合征相联系的危险因素是年龄、男性、慢性乙型肝炎携带者、肌氨酸酐的增高、发热的再次出现。出现了急性呼吸窘迫综合征的病例在第7、14以及21天的淋巴细胞计数与没有出现急性呼吸窘迫综合征的病例并没有显著的差别。在多元统计分析中，只有年龄和慢性乙型肝炎感染是有显著性的危险因素。
到撰写此报告时为止，75名病例在医院接受治疗的平均时间为22.1天（标准差为3.1），而出现了急性呼吸窘迫综合征的15名病例的平均治疗时间为26.8天。在研究期间有5 名病例死亡，其中2名病例，一名为79岁，另一名为64岁，分别在第13天和第17天出现了急性心肌梗塞。一名病例于第23天死于临床脓血症。另外两名病例分别于第24天和第25天死于临床脓血症和急性呼吸窘迫综合征。27名病例（36％）出院或转到康复机构。一名妊娠32周的孕妇病例转到产科专门机构分娩。在42名仍然留在医院接受治疗的病例中，其中有13名病例由于急性呼吸窘迫综合征在重症监护病房接受治疗。
记录了70名病例（93％）的IgG的血清转化，平均的出现时间为20天（标准差为5.1）。在最初收入院的时候（平均为发病后的3.2天，标准差为1.3），对75名病例通过逆转录聚合酶链反应测定法进行检测，并在24名病例（32％）的鼻咽部分泌物的样品中检测到了与SARS疾病相关的冠状病毒的RNA。在第14天有51名病例（68％）的样品检测到了RNA。在病程后期（平均在发病后的14.2天，标准差为2.2）收集到的67名病例的粪便样品中，在65份（97％）样品中检测到了病毒的RNA。在症状出现后的平均15.2天（标准差为1.7）收集到的74份尿液样品中，在31份（42％）样品中检测到了病毒的RNA。
对于最初记录在鼻咽部分泌物样品中用逆转录聚合酶链反应测定法检测到与SARS疾病相关的冠状病毒的RNA的20名病例，我们连续地进行了追踪并收集了后期的样品。对鼻咽部分泌物使用定量的逆转录聚合酶链反应测定法检测，显示出倒V字型的模式，病毒量的几何均数在第5、10以及15天分别为2.3ⅹ105/ml、1.9ⅹ107/ml和9.8ⅹ104/ml。
讨论：
关于SARS疾病的研究通常采用的是回顾性方法，或者是仅局限于对最初的临床学、血液学、放射学和微生物学结果的一些描述。然而我们所研究的病例是在确认暴发之后，很快被卫生部门严密监测起来的公寓居民。所有的公寓居民都进行了常规的卫生检查，病例一出现症状就很快地被收入医院，因此是在疾病的早期被收入医院的。为此我们能够通过选用此次社区暴发中的感染病例做成队列进行前瞻性研究，这些病例在流行病学上具有相关性。这些病例中的大多数都已被确认为感染了与SARS疾病相关的冠状病毒。
在我们的队列中，SARS疾病的临床进展大多数是相同的，是一个分为三个阶段的模式。第一周的主要特征是发热 、肌痛以及其它的全身症状，通常在几天之后好转。在这个阶段的病毒量的增加表明出现的症状大多数是与病毒的复制和细胞溶解有关。当疾病进展到第二周，病例通常会再次出现发热、并开始出现腹泻、氧饱合度降低。值得注意的是将近有半数的病例出现胸部阴影的移动。如果病毒导致的损害是主要的病理机制，如此的胸片快速变化是难以解释的。IgG的血清转化出现时间从第10天开始，似乎与出现在第10至15天的病毒量的下降有关系，尽管已经使用了甲基强的松龙。一些临床症状急剧加重的情况也是出现在这个时候，而这不能用无法控制的病毒复制来解释。使用逆转录聚合酶链反应测定法跟踪检测20名病例的鼻咽部分泌物、粪便和尿液样品，发现在症状出现后的第10天到21天病毒量逐渐减少，此项发现是支持上述结果的。综合起来看，这些研究结果表明在这个阶段的肺部损害是宿主过度反应的结果，而不是由于无法控制病毒复制。在这个队列中有20％的病例发展到了第三个阶段，特征是出现急性呼吸窘迫综合征且需要机械通气。在这个器官受到损害以及严重的淋巴细胞增殖的阶段中，一些病人不可避免地出现了医源性脓血症。
根据发病机理，在无胸腺小鼠的由呼吸道肠道病毒引起的肺部感染中，较低的接种量106与细支气管组织肺炎的病理改变相联系，而较高的接种量107与急性呼吸窘迫综合征相联系。为了减小发展到急性呼吸窘迫综合征慢性相的危险性，有效的抗病毒药以减少病毒量有可能是十分重要的。在撰写本报告的时候，没有研究发现有抗病毒药在临床治疗上是对此种新型的冠状病毒是有效的。病毒唑有着广谱的抗病毒效用，在由小鼠肝炎型冠状病毒引起的爆发性肝炎的治疗中是有效的。尽管病毒唑的抑制小鼠肝炎型冠状病毒的作用比较弱，但病毒唑能够减少小鼠巨噬细胞中的免疫原细胞素的释放，也能将小鼠的免疫应答由辅助T细胞2型转变为辅助T细胞1型。这样的话，尽管与抗病毒作用无关，病毒唑也可作为一种免疫调节剂。有效的抗病毒药是必需的，因为减少最初的细胞溶解损害以及减少在第一阶段中的病毒量有可能会导致在第二阶段的免疫病理学损害的减少。既然有较大比例的病例出现了急性呼吸窘迫综合征，与免疫学有关的方法的作用，例如使用皮质类固醇、静脉注射免疫球蛋白、富含IgM的免疫球蛋白、康复期的血浆以及抗肿瘤坏死因子胸腺肽，值得进一步的研究。
无法预料的是，慢性乙型肝炎感染是发生急性呼吸窘迫综合征的一个重要的独立的危险因素。这个结果也可以用于解释年青的中国病例的高死亡率是由于中国南方的慢性乙型肝炎的高感染率。此项结果是非常重要的，因为在我们的所有病例中，在使用皮质类固醇激素时都给予了lamivudine作为预防用药。但我们没有用乙型肝炎病毒DNA评估病毒量，因为病例的肝功能测试正常，而且没有出现慢性肝病的临床特征。因此这些病例的不良预后就不能用无法控制肝炎病毒的活性来解释。慢性乙型肝炎的携带者存在有尚不知道的免疫缺陷，可能是导致病人无法控制冠状病毒感染或引起的相关免疫病理学损害的原因。乙型肝炎携带者协同感染了SARS冠状病毒有可能预示着不良的预后。可以在家庭接触者和卫生保健工作人员开展选择使用了α-鼻内干扰素的预防措施的效果调查，尤其是对于那些慢性乙型肝炎的携带者，因为这种方法在其他的人类冠状病毒的感染中是有效的。
SARS的病例定义是临床上的，在缺乏接触史的流行病学资料时是非特异性。我们的研究表明在第28天出现IgG的血清转化的灵敏度为93％，尽管使用了皮质类固醇。既然这样，可检测SARS冠状病毒的IgG的同型特异性抗体。如果检测各种类型免疫球蛋白抗体，血清转化将有可能被更早地检测到。尽管鼻咽部分泌物样品中的病毒RNA的检测目前的灵敏度只有32％，多次测定鼻咽部分泌物和粪便样品会提高逆转录聚合酶链反应测定法的灵敏度。
病毒存在于厕所是一个重要的发现，因为这预示着病毒有粪--口传播的可能性。对于陶大花园的SARS疾病暴发的流行病学调查显示，此次暴发是由于下水道的破损而引起的。在我们的队列中病例出现腹泻的情况比以前的报道更为突出。这些病例所出现的严重水样腹泻给卫生保健工作人员的感染控制提出了新的挑战。这种临床症状的明显变化是否是与感染的不同途径有关，或者是与病毒突变有关仍然只是在推测之中。重要的是，我们所报告的死亡率为6.7％，比原先报告的在第21 天时的3.5％死亡率要高。
我们注意到自发性的纵隔气肿的高发性与气管插管和正压通气缺乏相关性。这个情况在原先的细胞巨化病毒肺炎和流感支气管炎中很少有报道。自发性的纵隔气肿通常在卡氏肺囊虫肺炎和金黄色葡萄球菌肺炎中报道。SARS病例的最初的胸片损害是以胸膜为基础的。一些病例最初出现合并病灶紧靠着纵隔，因此有可能在纵隔膜和肺膜的接触面上出现粘连和包囊。而任何一个包囊的破裂都会导致自发性的纵隔气肿。另外，在继胸膜粘连之后有可能胸在腔壁膜上出现弥散性周边肺改变，而此时破裂会出现在空出的纵隔位置上。这也可能是没有形成自发性的气胸而形成自发性的纵隔气肿的原因。
对呼吸道样品和粪便样品作逆转录聚合酶链反应测试以及血清学测试，能够在大多数的SARS病例中确定有与SARS疾病相关的冠状病毒的感染。疾病发展到呼吸衰竭有可能不是与无法控制病毒复制有关，本质上可能是一种免疫病理过程。
作者单位：
Departments of Microbiology and Medicine, Queen Mary Hospital,
University of Hong Kong, Hong Kong, Special Administrative
Region, China (Prof J S M Peiris DPhil, V C C Cheng MRCP,
I F N Hung MRCP, L L M Poon DPhil, B S F Tang MB, K H Chan PhD,
Y Guan PhD, B J Zheng PhD, Prof K Y Yuen MD); Department of
Medicine, Intensive Care, Radiology, and Pathology, United
Christian Hospital, Hong Kong (C M Chu MRCP, K S Chan FRCP,
K I Law MRCP, T Y W Hon FRCP, C S Chan FRCP, J S C Ng MB,
W L Ng MRCP, R W M Lai FRCPA)
Correspondence to: Prof K Y Yuen, Department of Microbiology,
University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Pokfulam Road,
Hong Kong, Special Administrative Region, China
(e-mail: kyyuen@hkucc.hku.hk)
